= Razvoj več-funkcionalnih hibridnih liposomov za aktivno zdravljenje rakavih obolenj in večmodalno diagnostiko =
<<BR>> ''[[ARRSProjekti/2018/SeznamARRSProjekti2018|Nazaj na seznam za leto 2018]]''

----
=== Oznaka in naziv projekta ===
Z2-9218 Razvoj več-funkcionalnih hibridnih liposomov za aktivno zdravljenje rakavih obolenj in večmodalno diagnostiko<<BR>>

=== Logotipi ARRS in drugih sofinancerjev ===
{{attachment:ARRS_logotip.jpg|© Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije|height="150"}}

=== Projektna skupina ===
Vodja projekta: [[https://www.sicris.si/public/jqm/search_basic.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=1&code1=cmn&code2=auto&search_term=nina%20kostev%C5%A1ek|dr. Nina Kostevšek]]

=== Vsebinski opis projekta ===
Več-funkcionalni liposomi, ki bodo razviti v sklopu tega projekta, predstavljajo elegantno in učinkovito rešitev za obstoječe pomanjkljivosti klasične kemoterapije in diagnostike. Sekvenčna organizacija projekta sledi končnemu cilju, to je predklinični potrditvi učinkovitosti "teranostičnega" sistema (teranostika = terapija+diagnostika). V prvem delu projekta bo poudarek na optimizaciji sinteze hibridnih liposomov in ex vitro vrednotenju delovanja posamezne aktivne komponente. V drugem delu projekta bo izvedeno obsežno in vitro testiranje na normalnih urotelijskih celicah, pol-diferenciranih in popolnoma diferenciranih urotelijskih rakavih celicah, s čimer bo ocenjena biokompatibilnost in stopnja internalizacije hibridnih liposomov za posamezno celično linijo, kar bomo dosegli s testiranji hibridnih liposomov z različnim številom aktivnih komponent. Pričakovati je, da bo zaradi aktivnega ciljanja preko monoklonskih protiteles, najvišja stopnja internalizacije pri rakavih celicah, medtem ko bo ta delež pri zdravih celicah minimalen. To bo dokazano z uporabo in vitro fluorescenčnega slikanja in MRI na vseh treh celičnih linijah z hibridnimi liposomi, s čimer bo dokazano jasno razlikovanje med normalnimi in rakavimi celicami. Nazadnje, selektivno zdravljenje rakavih celic in sproščanje zdravila na daljavo iz hibridnih liposomov bo dokazano s foto-termičnimi eksperimenti.

Vsebina projekta v vseh točkah sledi priporočilom Evropske komisije na področju raziskav v nanomedicini, podanih v dokumentu »Roadmaps in nanomedicine towards 2020« in najnovejšem »Strategic Research and Innovation Agenda For Nanomedicine 2016 – 2030«. Kot je razvidno iz teh dokumentov, je zaradi kompleksnosti in pogostosti pojava raka, razvoj novih in bolj učinkovitih proti-rakavih terapij v kombinaciji z napredno diagnostiko ključnega pomena za ohranjanje in izboljšanje kakovosti življenja. Z vlaganjem v razvoj tovrstnih »pametnih« nanomedicinskih sistemov, se povečuje tehnološka raven inovacij v Sloveniji, kar predstavlja bistven dejavnik pri konkurenčnosti na tujih trgih. Nadalje, hibridni sistem, predlagan v sklopu tega projekta, ni omejen zgolj na omenjene aplikacije, ampak s prilagoditvijo posameznih aktivnih komponent omogoča zdravljenje številnih bolezni, kjer je potreben učinkovit prenos zdravil in njihovo kontrolirano sproščanje.

Ključne besede: liposomi, magnetni nanodelci, foto-termična terapija, slikanje z magnetno resonance, activno tarčenje, rak, dostavni sistem za zdravila

Osnovni podatki sofinanciranja so dostopni na spletni strani. [[https://www.sicris.si/public/jqm/search_basic.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=1&code1=cmn&code2=auto&search_term=Z2-9218|Povezava na SICRIS]].
=== Faze projekta ===
Delo na projektu je razdeljeno na 3 delovne sklope (DS), razčlenjene na naloge, ki so zaporedno urejene proti končnemu cilju - razvoju hibridnih temperaturno-odzivnih liposomov za aktivno foto-termično terapijo in multimodalno diagnostiko.

1. DS1 je namenjen sintezi superparamagnetnih nanodelcev z različno sestavo in premerom približno 5 nm z ozko porazdelitvijo velikosti, kar je ključnega pomena za doseganje dobrega ujemanja med lipidnim dvoslojem in velikostjo nanodelcev. Sinteza in karakterizacija magnetnih nanodelcev bo potekala vzporedno in na koncu bomo lahko uporabili te nanodelce za formulacijo magnetnih liposomov.

2. DS2 obsega pripravo in strukturno karakterizacija praznih in magnetnih liposomov. V sklopu tega DS bodo izvedene sledeče naloge:

 * Sinteza in karakterizacija stabilnih praznih in magnetnih liposomov
 * Meritve relaksacijskih časov magnetnih nanodelcev in magnetnih liposomov
 * Sinteza ICG-liposomov in primerjava degradacijskega profila z raztopino ICG
 * Foto-termični eksperimenti na ICG raztopinah in ICG-liposomih
 * Enkapsulacija doksorubicina in določitev profila sproščanja zdravila za prazne in magnetne liposome in
 * Foto-termični poskusi na liposomih, ki vsebujejo DOX, in demostracija sproščanja zdravila na daljavo

3. DS3 bo zajemal izdelavo hibridnih liposomov, konjugiranih s protitelesi, in njihovo in vitro testiranje na normalnih urotelijskih celicah, pol-diferenciranih (RT4) in popolnoma diferenciranih urotelijskih rakavih celicah (T24):

 * Priprava hibridnih liposomov, konjugiranih s protitelesi
 * Študija citotoksičnosti na normalnih in rakavih celicah
 * Rezultati dobljeni na podlagi in vitro NIRF in MRI slikanja
 * Foto-termična terapija normalnih in rakavih celic, inkubiranih z različnimi skupinami liposomov


=== Realizacija in najpomembnejši dosežki ===

Program dela v celoti sledi in izpolnjuje časovne cilje v okviru delovnih sklopov in pripadajočih aktivnosti.

'''DS1. Sinteza in karakterizacija magnetnih nanodelcev (DS1 je bil 100 % realiziran)'''

''Cilj DS1: Monodisperzni nanodelci na osnovi FePt, Fe3O4 in MnFe2O4 z definiranimi magnetnimi lastnostmi in kristalno strukturo''

Uspešno smo sintetizirali magnetne nanodelce želenih velikosti in pripravili vodne suspenzije z izvedbo zamenjave površinkih ligandov. Aktivnost 1.1. je bila 100 % realizirana. Velikost nanodelcev, kristalna struktura in magnetne lastnosti so bile določene. Ne samo, da je bila Aktivnost 1.2. v celoti realizirana, opravljene so bile celo dodatne aktivnosti, ki so se izkazale za ključnega pomena pri sami formulaciji magnetnih liposomov (sinteza NDPM liganda). 


'''DS2. Priprava in strukturna karakterizacija praznih in magnetnih liposomov (vseh šestih aktivnosti je bilo 100% realiziranih)'''

''Cilj DS2: Priprava hibridnih magnetnih liposomov, ki vsebujejo ICG in DOX, karakterizacija profila sproščanja zdravila in določitev njihove učinkovitosti kot kontrastna sredstva za MRI''

Prazni in magnetni liposomi so bili uspešno formulirani v sklopu Aktivnosti 2.1 (100 % realizacija). V sklopu Aktivnosti 2.2. je bila izvedena karakterizacija formuliranih liposomov (velikost, temperatura faznega prehoda, morfologija preko dveh komplementarnih mikroskopskih tehnik in vsebnost Fe v vzorcih). Aktivnost 2.2. je bila 100% realizirana. 
Uporaba magnetnih liposomov kot izredno učinkovitega kontrastnega sredstva za MRI je bila potrjena v sklopu Aktivnosti 2.3. Zaradi 4x slabših magnetnih lastnosti, smo opustili pripravo FePt-liposomov. Smo pa zaradi izredno dobrih rezultatov dobljenih na Fe3O4-liposomih aktivnost dodatno razširili in pripravili magnetne liposome še s 6 drugačnimi lipidnimi sestavami. Razvili smo teorijo o povezavi fluidnosti lipidnega dvosloja, uspešnosti enkapsulacije nanodelcev in relaksivnosti. Glavni rezulat te aktivnosti je izbor magnetnih liposomov z najvišjo relaksivnostjo. Aktivnosti 2.3. je bila tako 100% realizirana. 

V sklopu Aktivnosti 2.4. smo uspešno pripravili ICG-liposome in ovrednotili njihovo temperaturno in foto-stabilnost, ter jih primerjali s prostim barvilom. Ta aktivnost je bila s tem 100% realizirana.  Kot primerjavo smo dodatno testirali tudi barvilo IR-820 in IR-820 liposome, ter izvedli še test hemotoksičnosti vseh vzorcev z barvili.  
Aktivnost 2.5. je obsegala sintezo in določitev profila sproščanja doksorubicina (DOX) iz praznih in magnetnih liposomov, kar je bilo 100% izvedeno. 
V sklopu Aktivnosti 2.6. smo dokazali, da lahko induciramo hitro sproščanje zdravila iz magnetnih liposomov pod vplivom laserskega obsevanja, medtem ko se ne-magnetni liposomi ne segrejejo in zato ne sprostijo zdravila. Cilj te aktivnosti je bil 100% dosežen.

'''DS3. In vitro študije: celična viabilnost, dvojno slikanje z MRI in NIRF, ter foto-termična terapija (vseh pet aktivnosti je bilo 100% realiziranih)'''

''Cilj DS3: Izdelava hibridnih liposomov, ocena njihove potencialne citotoksičnosti na normalnih in rakastih celičnih linijah ter dokazovanje njihove učinkovitosti za dvojno slikanje in sproščanje zdravila na daljavo''

V sklopu Aktivnosti 3.1. smo uspešno pripravili hibridne magnetne liposome, ki vsebujejo ICG in DOX, ter imajo na površino konjugirana protitelesa (100% realizacija). Namesto EGFR protiteles smo uporabili monoklonska protitelesa proti PD1 in na ta način h klasični kemoterapiji dodali še imunoterapijo. 
Uspešno smo izvedli in vitro študije na hibridnih liposomih in posameznih komponentah, kar je bil cilj Aktivnosti 3.2. Testirali smo na normalnih in rakavih celicah. Kvantitativno smo določili stopnjo internalizacije magnetnih liposomov in magnetnih nanodelcev v celice. Nato smo izvedli celične teste še na vzorcih z DOX, ter na koncu še na liposomih z anti-PD1 protitelesi. Cilj te aktivnosti je bil s tem 100% dosežen.
Cilj Aktivnosti 3.3. (in vitro NIRF slikanje) je bil celo presežen, ker smo celotno aktivnost nadgradili še z in vivo študijo na miših. Z fluorescenčnim slikanjem smo uspešno sledili DOX in ICG in določili akumulacijo v različnih organih. 
V sklopu Aktivnosti 3.4 smo uspešno izvedli in vitro MRI slikanje in pokazali izredno kontrastno učinkovitost magnetnih liposomov v primerjavi z prostimi nanodelci. Cilj te aktivnosti je bil s tem 100% dosežen. Dodatno smo izvedli tudi in vivo MRI študijo.
Aktivnost 3.5 je zajemala in vitro foto-termični eksperimente. Pokazali smo, da so izmed vseh testiranih vzorcev najbolj terapevstko učinkoviti magnetnimi liposomi z DOX, ker se po obsevanju z laserjem celična viabilnost najbolj zmanjša. Dokazali smo, da liposomi ne sprostijo zdravila, če niso izpostavljeni obsevanju, kar nakazuje potencialno selektivnost takšnega zdravljenja in občutno zmanjšanje stranskih učinkov. S tem je bil cilj te aktivnosti 100% realiziran. Dodatno smo izvedli tudi in vivo študijo in pokazali prednost kombinacije foto-termične terapije, kemoterapije in imunoterapije. 


=== Bibliografske reference ===
 * [[http://www.sicris.si/public/jqm/search_basic.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=1&code1=cmn&code2=auto&search_term=kostevšek%20nina|Reference   - SICRIS]]

[1] MA, Guanglong, KOSTEVŠEK, Nina, MARKELC, Boštjan, HUDOKLIN, Samo, ERDANI-KREFT, Mateja, SERŠA, Igor, ČEMAŽAR, Maja, MARKOVIĆ, Katarina, ŠČANČAR, Janez, et al. PD1 blockade potentiates the therapeutic efficacy of photothermally-activated and MRI-guided low temperature-sensitive magnetoliposomes. Journal of controlled release. 2021, vol. 332, 45 str., str. 419-433. DOI: 10.1016/j.jconrel.2021.03.002. [COBISS.SI-ID 54376707]

[2] KOSTEVŠEK, Nina et al., Magneto-liposomes as MRI contrast agents: a systematic Study of different liposomal formulations. Nanomaterials, 2020, vol. 10, no. 5, 889-1-889-18, doi: 10.3390/nano10050889. [COBISS.SI-ID 14045955]

[3] KOSTEVŠEK, Nina. A review on the optimal design of magnetic nanoparticle-Based T2 MRI contrast agents. Magnetochemistry, 2020, vol. 6, no. 1, str. 1-12, doi: 10.3390/magnetochemistry6010011. [COBISS.SI-ID 33264423]

[4] KOSTEVŠEK, Nina, MIKLAVC, Patricija, KISOVEC, Matic, PODOBNIK, Marjetka, AL-JAMAL, Wafa, SERŠA, Igor. Magneto-erythrocyte membrane vesicles' superior T2 MRI contrast agents to magneto-liposomes. Magnetochemistry. 2021, vol. 7, no. 4, str. 51-1-51-14. DOI: 10.3390/magnetochemistry7040051. [COBISS.SI-ID 59744259]

[5] MATURI, Mirko, LOCATELLI, Erica, SAMBRI, Letizia, TORTORELLA, Silvia, ŠTURM, Sašo, KOSTEVŠEK, Nina, COMES FRANCHINI, Mauro. Synthesis of ultrasmall single-crystal gold-silver alloy nanotriangles and their application in photothermal therapy. Nanomaterials. [Online ed.]. 2021, vol. 11, no. 4, str. 912-1-912-11. DOI: 10.3390/nano11040912. [COBISS.SI-ID 58412291]

[6] KOSTEVŠEK, Nina. Orožje so nanokapsule, tarča je rak. Delo, ISSN 0350-7521. [Tiskana izd.], 1. avg. 2019, vol. 61, št. 175, str. 14. [COBISS.SI-ID 32545319]

[7] KOSTEVŠEK, Nina, Engineering of nanoparticle-based magnetic resonance imaging contrast agents [key note lecture]. V: SIPS 2019, Sustainable Industrial Procesing Summit & Exhibition, 23-27 October 2019, Paphos, Cyprus. https://www.flogen.org/sips2019//scheduled_program_detailled.php?id1=307. [COBISS.SI-ID 32816167]

[8] KOSTEVŠEK, Nina et al., Magneto-liposomes as superior T2 MRI contrast agents: examples of nanoparticle and coating optimization. V: Abstracts book, NALS 2020, 2nd Internatinal Conference on Nanomaterials Applied to Life Sciences, 29th-31st January, Madrid, S. Madrid: Institute for Advanced Studies in Nanoscience. 2020. [COBISS.SI-ID 33141543]

[9] KOSTEVŠEK, Nina et al., Magneto-liposomes as excellent T2 MRI contrast agents. V: Cancer medicine - from the bench to the bedside: First CA17140 training school NANO2CLINIC, 8-11 April, 2019, Trieste, Italy: program and poster abstracts. Trieste: Università degli studi di Trieste. 2019, str. 24. [COBISS.SI-ID 32304935]

[10] KOSTEVŠEK, Nina et al., Liposomal-based T2 MRI contrast agents. V: Cancer nanomedicine - from the bench to the bedside: First CA17140 Training School NANO2CLINIC, October 15-17 Riga, Latvia : book of abstracts, (COST European Cooperation in Science & technology). [S. l.: s. n.]. 2019, str. 9. [COBISS.SI-ID 32837671]

[11] KOSTEVŠEK, Nina, et al., Superior T2 MRI contrast agents examples of nanoparticle and coating optimization. V: Conference book: 5th International Conference Current Trends in Cancer Theranostics, CTCT - 5.0, 30 June - 4 July, 2019, Trakai, Lithuania. Vilnius: Vilnius University. 2019, str. 52. [COBISS.SI-ID 32522023]

[12] KOSTEVŠEK, Nina et al., Multi-functional nanoparticles as a theranostic tool: photo-thermal cancer treatment and MRI imaging. V: BioNanoMed 2018 : congress documentation, 9th International Congress Nanotechnology in Medicine & Biology, 25-27 April 2018, Graz, Aus. [S. l.: s. n.]. 2018. [COBISS.SI-ID 31366183]

[13] KOSTEVŠEK, Nina et al., Temperature-sensitive magnetoliposomes for photothermally triggered drug release & MR imaging. V: Book of abstracts, ICONAN 2018, International Conference on Nanomedicine and Nanobiotechnology, Sept. 26-28, 2018, Rome, Italy, str. 192. [COBISS.SI-ID 31759143]

----
[[ARRSProjekti/SeznamARRSProjekti|Nazaj na seznam projektov po letih]]