Človeški katepsin F: nenavadna cisteinska proteaza udeležena v nevrodegeneraciji
Oznaka in naziv projekta
J1-2473 Človeški katepsin F: nenavadna cisteinska proteaza udeležena v nevrodegeneraciji
J1-2473 Human cathepsin F: An unusual cysteine protease involved in neurodegeneration
Logotipi ARRS in drugih sofinancerjev
Projektna skupina
Vodja projekta: prof. dr. Veronika Stoka
Sodelujoče raziskovalne organizacije: Povezava na SICRIS
Sestava projektne skupine: Povezava na SICRIS
Vsebinski opis projekta
Vsebinski opis projekta
Lizosomalni cisteinski katepsini imajo ključno vlogo pri različnih fizioloških in patoloških procesih, vključno s staranjem, nevrodegeneracijo in genetskimi obolenji. Njihova nekontrolirana aktivnost vodi do številnih bolezni pri človeku in so zato posledično primerne tarče za iskanje zdravilnih učinkovin. Med enajstimi človeškimi katepsini je vsekakor katepsin F manj raziskana in okarakterizirana proteaza. Nedavno odkritje več mutacij v genu človeškega katepsina F je bilo ključnega pomena za ugotovitev, da je ta encim povezan s Kufsovim obolenjem tipa B, pozno obliko nevronalne ceroidne lipofuscinoze (CLN13). Raziskave so predvsem usmerjene k razumevanju vpliva mutacij katepsina F na njegovo encimsko aktivnost, procesiranje prekurzorja katepsina F, in biološko vlogo njegove proregije, ki vsebuje cistatinu podobno domeno. Glavni cilji tega originalnega projekta so razumevanje molekularnih mehanizmov in bioloških funkcij katepsina F s pomočjo interdisciplinarnega pristopa in integracije dobljenih informacij za poglobljeno razumevanje NCL na molekularni ravni.
Osnovni podatki sofinanciranja so dostopni na spletni strani Povezava na SICRIS.
Faze projekta in opis njihove realizacije
1. Faza: Priprava rekombinantnega človeškega katepsina F in njegovih patoloških mutant za karakterizacijo in določitev 3D struktur
Človeški katepsin F spada med težje proteine za kloniranje in izražanje. V tem času smo uporabili več dostopnih orodij za modeliranje človeškega katepsina F. Poleg tega smona razpoložljivi 3D strukturi zrele oblike človeškega katepsina F ovrednotili učinek mutacij najdenih pri bolnikih, z Kufsovo boleznijo tipa B (CLN13). Ti rezultati so prvič jasno pokazali destabilizacijski učinek vseh ocenjenih mutantov in tako zagotovili strukturne osnove za razumevanje škodljivih učinkov, potrjenih v funkcionalnih študijah (2. Faza). Preliminarni poskusi so bili izvedeni na celičnem modelu z imunoprenosom človeškega katepsina F.,Rezultati so pokazali, da obstaja poleg monomera tudi encim v dimerni obliki. Predhodno smo uporabili za našo študijo kot model rekombinantni katepsin X in ugotovili na osnovi strukturnih podatkov, da obstaja v dimerni obliki kar dosedaj ni bilo znano. To smo potrdili tudi z drugimi metodami in objavili [COBISS.SI-ID 42300419].
2. Faza: Določitev mehanizma smrti nevronskih celic s poudarkom na katepsinu F
Funkcijska karakterizacija vseh 5 mutantov CLN13, najdenih pri pacientih s Kufsovo boleznijo tipa B ter divji tip proteina smo izrazili v nevronom podobnih SH-SY5Y celicah. Ugotovili smo prisotnost agregatov, ki se razgradijo kot posledica avtofagije. Pri tem delu, smo uporabili metodologijo za spremljanje avtofagije kot smo opisali [COBISS.SI-ID 58013955]. Nenazadnje, mutacije CLN13 povzročijo spremembe v celični homeostazi, ki so karakteristične za skupino nevronalnih ceroidnih lipofuscinoz.
3. Faza: Identifikacija bioloških omrežij človeškega katepsina F