Eritrocitne membrane kot nano-nosilci za gensko terapijo za zdravljenje raka
Oznaka in naziv projekta
J4-50150 Eritrocitne membrane kot nano-nosilci za gensko terapijo za zdravljenje raka
J4-50150 Erythrocyte membrane-based nanocarriers for gene silencing cancer therapy
Logotipi ARIS in drugih sofinancerjev
Projektna skupina
Vodja projekta: dr. Nina Kostevšek
Sodelujoče raziskovalne organizacije: Povezava na SICRIS
IJS
18824 - Kristina Žužek (R)
53417 - Tina Radošević (T)
28491 - Kristina Žagar Soderžnik (R)
54688 - Giulia Della Pelle (MR)
7561 - Boris Turk (R)
15969 - Ivica Štefe (T)
33762 - Robert Vidmar(R)
39130 - Monika Biasizzo(R)
57087 - Sara Ivanovski (MR)
ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA
34373 - Maša Bošnjak (R)
14575 - Maja Čemažar (R)
19058 - Simona Kranjc Brezar (R)
33227 - Tanja Jesenko (R)
51848 - Tim Božič (R)
8800 - Gregor Serša (R)
32175 - Boštjan Markelc (R)
36367 - Urša Lampreht Tratar (R)
37534 - Katarina Žnidar (R)
55825 - Iva Šantek (R)
Vsebinski opis projekta
Vsebina raziskovalnega projekta SLO
V tem projektu predlagamo nov koncept zdravljenja in diagnostike raka, ki temelji na večfunkcijskem biomimetičnem nano-sistemu, sestavl iz telesu lastnih celic kot dostavnega sistema za zdravila. Nanodelci ali druge aktivne komponente, preoblečene s celičnimi membranami, lah delujejo kot avtogene celice in tako zagotovijo inherentno biokompatibilnost in povečajo čas cirkulacije v krvnem obtoku. Zato predlagamo up membran rdečih krvnih celic (MRKC) dostavnega sistema za zdravila. Predlagani biomimetični sistem bo omogočil gensko terapijo tumorskih metastaz z vnosom siRNA za utišanje genov, fototermično terapijo in fluorescenčno slikanje. Da bi to uresničili, bodo MRKC vsebovale sledeče komponente: 1. siRNK za gensko terapijo za zdravljenje raka, 2. barvilo indocianin zeleno (ICG), ki omogoča oboje, fototermično terapijo in fluorescenčno slikanje.
Ker so tumorji odvisni od angiogeneze, ima ciljanje endoglina, markerja endotelijskih celic, velik potencial pri zdravljenju trdnih tumorjev in tumetastaz pri raku dojke in debelega črevesa. Določili bomo biorazdelitev in učinkovitost dostave genov in vivo. Sekvenčna organizacija projeksledi končnemu cilju, to je predklinični potrditvi učinkovitosti teranostičnega sistema. Projekt je zasnovan tako, da bodo rezulati vseh delovnihsklopov pripeljali do končnega cilja, tj. razvoja predkliničnega teranostičnega sistema, ki bo omogočil gensko terapijo z enkapsulirano siRNA, fototermično terapijo za senzibilacijo tumorjev in fluorescenčno slikanje, njegova učinkovitost pa bo ocenjena in vivo. V prvem delu projekta bpoudarek na sintezi in ex vitro vrednotenju delovanja vsake aktivne komponente posebej pred pripravo končnega hibridnega sistema. Posebnanaloga bo namenjena karakterizaciji membranskih nosilcev, tako da bomo določili sestavo teh membran in jih primerjali s sestavo izvirne celičmembrane, kar je ključno, če želimo zagotoviti varnost in dolg čas cirkulacije predlaganih nosilcev. V drugem delu projekta se bodo izvajala in vitro testiranja na normalnih in rakavih celicah, da se oceni citotoksičnost in akumulacija vsake posamezne komponente in ICG/siRNA-MRKC. koncu bo ocenjena učinkovitost utišanja genov s siRNA. Na osnovi obsežnih poskusov in vitro, bodo zasnovan končni ICG/siRNA-MRKC nosilebo uporabljen za in vivo testiranje. Določili bomo bioporazdelitev in farmakokinetiko intravenozno injiciranih teranostičnih nanostruktur, ter njihpotencial za gensko terapijo. Podobna testiranja so že bila izvedena s sintetičnimi liposomi, vendar je predlagan nanosistem z biomimetičnimMRKC popolna novost in predstavlja velik korak naprej na tem novo razvijajočem se področju biomimetične nanomedicine. Poleg tega bomo uporabili še fototermično terapijo kot dodatek genski terapiji za izboljšanje izida zdravljenja.
ANG
This proposal addresses new concepts in cancer treatment and diagnostics based on a multi-functional biomimetic nanosystem made of bo own cells as drug carriers. Disguised with cell membranes, the nanoparticles or other active components can act as autogenous cells and thu ensure the inherent biocompatibility and increase the circulation time. Therefore, we propose to use erythrocyte membrane, namely erythrocy membrane vesicles (EMVs), as a drug delivery system. The proposed biomimetic system will enable gene therapy of tumour metastases by delivering siRNA for gene silencing and photothermal therapy. To realize this, the EMVs will be encapsulated with: 1. siRNA for gene silencing cancer therapy and 2. indocyanine green (ICG) that enables both photothermal treatment and fluorescent imaging.
As tumors depend on angiogenesis, targeting endoglin, an endothelial cell marker, has potential in the treatment of solid tumours, as well as metastasis in both breast and colon cancers. Our membrane-based carriers will be evaluated in terms of biodistribution and gene delivery eff The project is organized sequentially towards the final goal – the development of a preclinical proof-of-concept-efficient theranostic system. I first part of the project, the focus will be on the synthesis and ex vitro evaluation of the performance of each active component separately bef constructing the final hybrid system. The special task will be dedicated to the characterization of membrane-carriers in terms of membrane composition and compared to the membrane composition of original cells, which is crucial to ensure non-immunogenicity and long circulation of EMVs. In the second part of the project, in vitro testing on normal and cancerous cells will be performed to evaluate the cytotoxicity and the cellular uptake of each individual component and EMVs containing siRNA and ICG. Finally, siRNA gene silencing efficiency will be evaluated. B on the extensive in vitro experiments, the final ICG/siRNA-EMVs will be designed and used for the subsequent in vivo testing. Biodistribution a pharmacokinetics of intravenously injected nanocarriers and their potential for gene silencing will be determined. Similar reports can be found synthetic liposomes, but the as-proposed nanosystem with a biomimetic EMVs is a complete novelty and represents a huge step forward in th newly evolving field of biomimetic theranostic nanomedicine. Moreover, photothermal treatment will be used as adjuvant to gene therapy to im the outcome of the treatment.
Osnovni podatki sofinanciranja so dostopni na spletni strani SICRIS.
Faze projekta in opis njihove realizacije
Glavni cilji projekta v obdobju 1.10.2023-31.3.2025 so bili doseženi z izvedbo specifičnih nalog znotraj posameznih delovnih sklopov (DS), ki so predstavljene v nadaljevanju:
DS1. Formulacija in karakterizacija veziklov (M1-9) Uspešno smo pripravili stabilne vezikle iz celičnih membran, ki služijo kot dostavni sistem za nukleinske kisline. Morfologijo veziklov smo ovrednostili z različnimi mirkoskopskimi metodami: klasična presevna elektronska mikroskopija, krio-elektronsko mikroskopijo in »freeze-fracture« mikroskopijo [1]. Tako pripravljeni vezikli vsebujejo 0.240 ± 0.09 mg/ml fosfolipidov (Stewartova metoda) in 0.46 mg/ml ± 0.01 protein (Bradfordova metoda). Vsi ti rezultati so objavljeni v [1]. S tem je DS1 uspešno zaključen. Kot dodatno aktivnost smo izvedli in objavili veliko sistematično študijo, kjer smo ovednotili vse predklinične študije, ki so uporabile vezikle na osnovi eritrocitnih membran za enkapuslacijo različnih zdravilnih učinkovin, in pojasnili njihovo usodo v smislu biološke porazdelitve in farmakokinetike. Podana pa je bila tudi kritična diskusija in smernice za razvoj veziklov v prihodnosti za čim hitrejši prenos v klinično fazo raziskav [2].
DS2. Proteomska analiza veziklov in celih eritrocitov Naloga 2.1. Standardizacija vzorcev in MS analiza visoke ločljivosti (M6-15) Analizirali smo 4 različne vzorce: a) celi eritrociti, b) eritrocitne membrane, c) vezikli in d) očiščeni vezikli z uporabo ultracentrifuge. Za vse vzorce smo določili koncentracijo proteinov in jih pripravili na 3 načine za analizo z masno spektroskopijo (LC-MS/MS): a) nanos na gel za SDS-PAGE elektroforezo, b) v raztopini in c) v raztopini z magnetnimi kroglicami. Zadnji dve metodi sta se izkazali za najbolj primerni za nadaljne analize. SDS-PAGE rezultati [1] nakazujejo, da med samo pripravo veziklov ne izgubimo bistveno veliko proteinov. Bolj natančni MS rezultati pa so še v postopku obdelave. Naloga 2.1 je tako 80% realizirana. Naloga 2.2. Imunološka detekcija in kvantifikacija izbranih markerjev membranskih proteinov (M12-15) Ovrednotili smo 4 membranske proteine, ki so prisotni v membranah eritrocitov, z osrednjo vlogo pri imunskem odzivu in opsonizaciji veziklov v krvnem obtoku: CD47, CD55, CR1 in band-3 protein. Za vsak posamezen protein je bilo potrebno postaviti drugačen protokol, ker se razlikujejo v koncentraciji, odzivu na primarna protitelesa in označevalce. Analize so zaključene. Rezultati so bili predstavljeni na dveh simpozijih [3,4]. Publikacija je v pripravi. Naloga 2.2 je tako 100% realizirana.
DS3. Priprava ICG/siRNA-veziklov Naloga 3.1. Sinteza in karakterizacija ICG-veziklov (M6-15) Uspešno smo v vezikle enkapsulirali molekulo indocianin zeleno (ICG) v namen fototermične terapije in fluorescenčenga slikanja. Presežek molekule je bil odstranjen z gelsko izključitveno kromatografijo. Opravili smo študije temperaturne stabilnosti proste in enkapuslirane ICG, ter določili optimalni protokol za priporavo veziklov z visoko koncentracijo ICG. Rezultati so bili predstavljeni na vabljenih predavanjih na nacionalnem simpoziju [5] in v Milanu, Italija [3]. Naloga 3.1. je tako 100% realizirana.
Naloga 3.2. Določitev foto-termičnega efekta ICG-veziklov (M9-18) Prosto in enkapsulirano molekulo ICG smo obsevali z laserjem z različno močjo in spremljali temperaturni odziv. Določili smo stopnjo foto-razgradnje ICG z meritvami absorpcije pred in po obsevanjem. ICG-vezikli izkazujejo visok foto-termični efekt (segrejejo se za 30°C po 5 minutnem obsevanju s P=3W, λ=808 nm, 10 μg/mL ICG), kar je bistveno več, kot je potrebno za terapijo (5-8°C), zato bomo uporabili nižje koncentracije ICG. Ključni rezultat je, da ICG-vezikli izkazujejo nižjo foto-degradacijo po obsevanju kot prosta ICG. Rezultati so bi predtavljeni na simpoziju [5]. Znanstveni članek je v pripravi. Naloga 3.2 je tako 100% realizirana.
Naloga 3.3. Sinteza in karakterizacija siRNA-veziklov (M9-21) siRNK smo uspešno enkapsulirali v vezikle. Testirali smo različne metode odstranitve proste siRNK: gelska izključitvena kromatografija, centrifugalne filtrirne naprave, klasično in ultracentrifuguiranje s spreminjanjem gostote. Zadnje se je izkazalo za najbolj učinkovito. Učinkovitost enkapsulacije siRNK je 68%. Z gelsko elektroforezo smo dokazali, da vezikli obvarujejo siRNK pred encimsko razgradnjo.
Dodatno smo izvedli še dve aktivnosti: - Preučevanje siRNK-veziklov z napredno super-ločljivostno fluorescenčno mikroskopijo, kjer smo vezikle in siRNK označili z različnima fluoroforoma in opazovali kolokalizacijo, da smo dodatno potrdili vsebnost siRNK v veziklih - Postavili smo nov protokol za dolgoročno shranjevanje siRNK-veziklov. siRNA-vezikli so bili posušeni z zamrzovanjem v prisotnosti različnih krioprotektantov: saharoze, trehaloze in PVP40. Za ohranitev morfologije veziklov in aktivnosti siRNK, se je kot najbolj učinkovita izkazala saharoza. Rezultati vseh opisanih aktivnosti znotraj Naloge 3.3 so bili objavljeni v članku z visokim faktorjem vpliva [1]. Naloga 3.3 je tako 100% realizirana.
Naloga 3.4. Priprava in karakterizacija ICG/siRNA-veziklov (M15-24) Naloga se še izvaja in rezultati bodo objavljeni predvidoma prihodnje leto. Nedavno smo začeli s pripravo veziklov, ki vsebujejo tako ICG kot siRNK. Postavili smo protokol za ko-enkapsulacijo obeh molekul. Za odstranitev prostih molekul smo uporabili velikostno izključitveno kromatografijo. Naloga 3.4 je tako 80% realizirana.
DS 4 – In vitro eksperimenti Naloga 4.1. Določitev citotoksičnosti (M18-27) Citotoksičnost siRK-veziklov in vseh ustreznih kontrol smo ovrednotili v širokem koncentracijskem področju in na petih različnih celičnih linijah [1]. V vseh primerih ni bilo zaznati znižanja celične viabilnosti. V teku pa so analize toksičnosti ICG-veziklov. Naloga 4.1 je tako 50% realizirana.
Naloga 4.2. Študija internalizacije (M18-M27) Spremljali smo pot internalizacije siRNK-veziklov v izbrano celično linijo preko fluorescenčnih označevalcev s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo [1]. V teku pa so celični testi z endosomskimi markerji za določitev stopnje endosomskega pobega veziklov. Naloga 4.2 je tako 70% realizirana.
Naloga 4.4 In vitro določitev utišanja tarčnega gena (M21-30) Ustvarili smo celično linijo, ki izraža fluorescenčen protein tdTomato. V vezikle smo enkapsulirali siRNA proti tdTomato. S PCR analizo smo dokazali 80% učinkovitost utišanja tarčnega gena. Z zamrznjemimi vzorci je učinkovitost padla na 50% [1]. Testi angiogeneze z utišanjem gena za izražanje endoglina se še niso pričeli. Naloga 4.4 je tako 50% realizirana. Rezultati so bili predstavljeni na vabljenem predavanju [6].
Nalogi 4.3. in 4.5 se še nista pričeli izvajati (M21-30)
Reference
[1] G. D. PELLE et al., ‘Red Blood Cell Membrane Vesicles for siRNA Delivery: A Biocompatible Carrier With Passive Tumor Targeting and Prolonged Plasma Residency’, IJN, 20, 3269–3301, 2025, doi: 10.2147/IJN.S504644 [COBISS.SI-ID 229252355]
[2] KOSTEVŠEK, Nina, ‘Erythrocyte membrane vesicles as drug delivery systems: A systematic review of preclinical studies on biodistribution and pharmacokinetics’, Biomaterials Advances, 170, 214234, 2025, doi: 10.1016/j.bioadv.2025.214234. [COBISS.SI-ID 226354435]
[3] KOSTEVŠEK, Nina. Erythrocyte-based vesicle as a biomimetic platform for drug delivery: presented at SCITEC CNR & JSI: Scientific Dialogues, 6. February 2024, Milano. [COBISS.SI-ID 186961667]
[4] KOSTEVŠEK, Nina. Bio-inspired nanocarriers for therapeutic nucleic acid delivery: presented at Mini symposium "Challenges in Drug Delivery", 17.9.2024, Ljubljana. [COBISS.SI-ID 208324355]
[5] KOSTEVŠEK, Nina. Photothermal treatment and magnetic resonance imaging with nanomaterials: Mini-symposium "Development of biomimetic carriers for gene therapy for cancer treatment", 26.3.2024, IJS. [COBISS.SI-ID 190873091]
[6] KOSTEVŠEK, Nina. The importance of materials in the service of the community and humanity – the example of cancer therapy. Innovation day Ljubljana, Slovenia, 2024 [COBISS.SI-ID 216477443]
Objavljeni članki
[1] G. D. PELLE et al., ‘Red Blood Cell Membrane Vesicles for siRNA Delivery: A Biocompatible Carrier With Passive Tumor Targeting and Prolonged Plasma Residency’, IJN, 20, 3269–3301, 2025, doi: 10.2147/IJN.S504644 [COBISS.SI-ID 229252355]
[2] KOSTEVŠEK, Nina, ‘Erythrocyte membrane vesicles as drug delivery systems: A systematic review of preclinical studies on biodistribution and pharmacokinetics’, Biomaterials Advances, 170, 214234, 2025, doi: 10.1016/j.bioadv.2025.214234. [COBISS.SI-ID 226354435]
[3] DELLA PELLE, Giulia, BOŽIČ, Tim, VUKOMANOVIĆ, Marija, SERŠA, Gregor, MARKELC, Boštjan, KOSTEVŠEK, Nina. Efficient siRNA delivery to murine melanoma cells via a novel genipin-based nano-polymer. Nanoscale advances. Sep. 2024, vol. 6, iss. 18, str. 4704-4723, ilustr. ISSN 2516-0230. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/na/d4na00363b, DOI: 10.1039/D4NA00363B. [COBISS.SI-ID 205555459]